Реферат на тему: Ліки - Медицина та здоров'я - Реферати - Каталог статей

Реферат на тему: Ліки. ЗМІСТ ВСТУП ДОКЛІНІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ Токсичність Мутагенність Канцерогенність Екофармакологічна дія Механізм фармакологічної дії препарату Хіміотерапевтичний індекс Антігерпетична активність Протефлазіду Вивчення антігерпетичної активності препарату Протефлазід у досвідах in vitro Вплив препарату Протефлазід на мітотичний режим і хромосоми клітин ЧЕТ, заражених вірусом герпесу Вивчення антігерпетичної активності Протефлазіду в експериментах in vivo Вивчення впливу Протефлазіду на хромосоми клітин кісткового мозку мишей, заражених вірусом герпесу Вивчення впливу Протефлазіду на моделі полового герпесу Вивчення впливу Протефлазіду на моделі герпетичного кератиту в кролів Вивчення анті-ВІЧ активності препарату Протефлазід Механізм дії Протефлазіду Інтерфероногенна активність препарату в культурі лейкоцитів Вивчення індукції інтерферону in vivo Вплив Протефлазіду на тімідінкиназну активність у клітинах мозку мишей, заражених вірусом простого герпесу Вплив Протефлазіду на ДНК-полімеразну активність у клітинах мозку мишей, заражених вірусом герпесу Вивчення дії Протефлазіду на антіоксідантний статус клітин Вплив Протефлазіду на інтенсивність свободнорадікальних процесів, індукованих пероксидом водню Модулюючої дії, Протефлазіду на цитотоксичні й апоптичені ефекти протипухлинних препаратів Вплив препарату Протефлазід на стан гена з-myc у культурах злоякісних лімфоїдних клітин людини ГЕРПЕС ВІРУСНА ІНФЕКЦІЯ ЛІКУВАННЯ ГЕРПЕС ВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ ПРЕПАРАТОМ ПРОТЕФЛАЗІД ВІРУСНИЙ ГЕПАТИТ ОЦІНКА ЕФЕКТИВНОСТІ ПРЕПАРАТУ ПРОТЕФЛАЗІД У ЛІКУВАННІ ПЕРВИННОЇ ТА РЕЦИДИВУЮЧОЇ ІНФЕКЦІЇ, ОБУМОВЛЕНОЇ Herpes genitalis У ЖІНОК ПРОТЕФЛАЗІД В КОМПЛЕКСНІЙ ТЕРАПІЇ ЗАПАЛЬНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ ВНУТРІШНІХ СТАТЕВИХ ОРГАНІВ В ЖІНОК ПОСТРЕЄСТРАЦІЙНІ КЛІНІЧНІ НАУКОВІ ДОСЛІДЖЕННЯ ПРЕПАРАТУ ПРОТЕФЛАЗІД В ДАНИЙ ЧАС ПЕРЕЛІК ДЖЕРЕЛ ВИКОРИСТАНИХ ПРИ СКЛАДАННІ "Інформаційних матеріалів" СПИСОК СКОРОЧЕНЬ ЛІТЕРАТУРА ВСТУП Незважаючи на те, що за останні десятиліття світовий фармацевтичний ринок поповнився десятками нових антівірусних препаратів, проблема профілактики і терапії найбільш розповсюджених інфекцій залишається актуальною. Усі відомі до дійсного часу антівірусні препарати можна розділити на наступні групи (Ф.І.Єршов, 1998р.): хіміопрепарати; інтерферони; індуктори інтерферонів; імуномодулятори. При удаваному різноманітті препаратів перерахованих груп більшість хворих страждаючих від вірусних інфекцій, особливо вірусними гепатитами, інфекціями ЦНС, ВІЧ (СПІДом) і ін. практично не мають безпечних ефективних терапевтичних засобів. Вперше високоефективні препарати з рослинної сировини були використані в онкології. Так, серед широко застосовуваних цитостатиків слід зазначити вінбластін, вінкрістін, виділених з барвінку рожевого, і колхамин і колхацин, отриманих з барвінку чудового. Важливим критерієм добору речовин, одержуваних з рослин, як і хіміопрепаратів, є їх хіміотерапевтичний індекс, тобто відношення максимально стерпної концентрації (поріг дії, що ушкоджує, на неінфіковані клітини) до мінімальної специфічної активності препарату. Особливу увагу залучають групи біологічно активних речовин рослин, що характеризуються порівняно низькою токсичністю і мають виборчу, специфічну фармакологічну дію на організм людини. Однією з таких груп є флавоноїди, що відносяться до фенольних сполук рослин. Біологічна і фармакологічна дія флавоноїдів до дійсного часу вивчено досить широко. Флавоноїди чи флавонові вітаміни являють собою групу біологічно активних фенольних сполук, основу молекули яких складає флавановий кисневміщуючий гетероцикл. До флавоноїдів відноситься близько 4000 різних сполук, основними групами яких є катехіни, флаванони і флавони, причому у випадку флавонів біологічною активністю володіють їхні гликозіди. Усі флавони не синтезуються в організмі тварин і надходять з рослинною їжею. Біофлавоноїди є широко розповсюдженими компонентами харчового раціону, деякі речовини цієї групи використовуються також у виді біодобавок. Хоча речовини цієї групи були відкриті вже кілька десятиліть тому назад, їхнє значення для організму тварин і людини остаточно ще не встановлено, особливо, приймаючи до уваги значну різнорідність заступників флавонового гетероциклу. Однозначно встановлено, що всі сполуки цього типу володіють антіоксідантними властивостями, завдяки чому вони виконують захисні функції в рослинах, охороняючи їх від несприятливих впливів зовнішнього середовища. Очевидно, антіоксідантна активність цих сполук має визначене значення й в організмі тварин і людини, хоча функції їхні можуть не обмежуватися лише участю в окислювально-відновних процесах [1, 2, 3]. Останнім часом показано, що деякі біофлавоноїди можуть служити як природних агентів хіміопрофілактики ракових захворювань, при цьому деякі з них, зокрема, генистеїн, роблять безпосереднє інгібіруючий вплив на ріст пухлинних клітин. Кверцетин, у даний час проходить першу фазу клінічних іспитів у якості потенційного протипухлинного препарату. У роботах ряду авторів продемонстроване гальмування росту деяких ліній пухлинних клітин у культурі під дією ряду флавоноїдів, що відносяться до різних груп [4, 5]. Разом з тим, ряд природних і синтетичних флавоноїдів інгібіруют мутагенну дію продуктів метаболичної активації бензпирена [6]. У ряді робіт було показано, що деякі флавоноїди мають противірусну активність, у тому числі й у відношенні ретровирусов [7, 8]. В останньому випадку було показано, що деякі флавоноїди мають здатність інгібірувати зворотну транскриптазу цих вірусів [7]. Цілком ймовірним може виявитися, що флавоноїди будуть інгібірувати активність і цілого ряду інших ферментів, як клітинних, так і вірусних, що може бути одним з механізмів їхньої антівірусної та антіпролиферативної дії на додаток до тих ефектів, що прямо чи побічно опосредуються антіоксідантними ефектами цих сполук. ПРЕДСТАВЛЕННЯ ПРЕПАРАТУ Короткий опис сполуки і біохімічних властивостей препарату. Лікарська форма препарату "Протефлазід" - це рідкий спиртовий екстракт, отриманий з диких злакових рослин Deschampsia caespitosa L. і Calamagrostis epigeios L. Нами вивчена фізико-хімічна сполука трав, і матеріали вивчення оформлені у виді фармакологічних статей на трави (Фармакопейні Статті до Реєстраційного Посвідчення № P.02.01/02777). У якісному відношенні фізико-хімічні сполуки цих трав подібні: група флавоноїдів (флавони, флавонони, флавоноли) у вільній і глікозілірованій формі, стандартні для злаків амінокислоти, хлорофіли. У ході оригінального технологічного процесу одержання препарату, екстраговані групи речовин утворюють комплексні сполуки. Кількісно препарат Протефлазід аналізують по змісту карбонових кислот, флавоноїдів у перерахуванні на рутин. Основними біологічно активними речовинами Протефлазіду є флавоноїди подібні кверцетину (рутину), основу молекули яких утворює флавоновий кисневміщуючий. Флавоноїди відносяться до природних фенольних сполук. Відмінність спектра флавоноїдів, що містяться в Протефлазіді від кверцетина полягає в наявності різних радикалів в ароматичній частині молекули. Від рутину речовини Протефлазіду відрізняються ступенем глікозілірування, місцем приєднання вуглеводних залишків і їхньою природою, конфігурацією глікозідних зв'язків. Специфічні властивості Протефлазіду визначаються тим, що у фармакологічному плані в умовах організму ми маємо справу з дією не одного фенолу - флавоноїду, а з ефектом системи біохімічних перетворень із присутністю високоактивних проміжних продуктів-радикалів. До дійсного часу метаболізм рослинних флавоноїдних сполук (З6 - З3 - З6) вивчений досить повно. Встановлено, що природні фенольні сполуки в організмі "згоряють" чи цілком інактивуються. В останні роки, ученими встановлено, що в ряді випадків біофлавоноїди можуть викликати специфічну перебудову деяких генів, зокрема MLL, що приводить до індукції вторинних лейкозів./Strick et al. 2000/. У цьому аспекті нами на базі Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології НАН України проведені дослідження з виявлення впливу Протефлазіду на специфічні перебудови гена с - myc, що є такою же специфічною мішенню, як і ген MLL. Установлено, що Протефлазід не приводить до специфічних перебудов гена с - myc, тобто не приводить до індукції вторинних лейкозів. Форма випуску: краплі для внутрішнього і зовнішнього застосування у флаконах по 25 ml з краплеміром, по 30 ml, 50 ml у флаконах. Фармакокінетика При застосуванні per os препарат усмоктується частково в шлунку і, в основному, у тонкому відділі кишечнику. Невелика кількість флавоноїдів піддається розпаду при первинному проходженні через печінку (пресистемний метаболізм), основна частина розподіляється по органах і тканинах, проникає в інфіковані вірусом клітини. При введенні per os флавоноїди препарату метаболізуються цілком, ні в сечі, ні в калі слідових кількостей флавоноїдів не виявляється. У дорослих остаточний період напіввиведення коливається в межах 5 - 9 годин, що обумовлює призначення препарату тричі на добу. Фармакодинаміка Протефлазід має антівірусну дію внаслідок блокування вірус специфічних ферментів (тімідінкиназа, ДНК - полімераза). Протефлазід є індуктором синтезу ендогенного альфа -, гама - ІФН. Протефлазід володіє апоптозмодулюючою та антіоксидантною активністю. ДОКЛІНІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ Доклінічне вивчення Протефлазіду проводилося з метою визначення терапевтичної ефективності препарату стосовно основних анатомічних і фізіологічних систем організму, а також для дослідження специфічної дії, що ушкоджує: алергизуючого, канцерогенного, мутагенного. Токсичність Оцінка безпеки використання препарату рослинного походження Протефлазід проводилася відповідно до вимог ДСТ 12.1.007-76. Вивчення гострої токсичності при введенні per os (спосіб, що планується для використання в практиці), нашкірно та внутрішньочеревно проводили на трьох видах дорослих тваринних обох статей (білі миші і білі пацюки, коти). Дігистивне і внутрішньочеревне введення препарату забезпечували відповідно до загальноприйнятих методичних рекомендацій, що регламентуються тільки фізиологічністю обсягу введення рідини стосовно маси тіла досліджуваної тварини. Варто підкреслити, що при аплікації препарату враховувалася як маса тіла, так і площа, на яку наносили препарат. У залежності від дози Протефлазіду реєстрували загибель тварин. При введенні максимально можливих фізіологічних доз препарату (у білих пацюків і мишей) загибель відбувалася протягом 2-х годин з моменту аплікації. Зменшення доз препарату "подовжувало" прояв клініки токсичної дії препарату. Необхідно підкреслити, що обмеження тварин у вживанні рідини протягом перших 5-8 годин після маніпуляції, було однаковим у контрольній і дослідній групах. У відношенні до стандартного раціону, що використовували у віварії, особливостей, що свідчили б про відхилення від норми, не було. Факт істотної, статистично підтвердженої різниці в значенні LD50 для мишей (9453.3-10315.8 мг/кг) і пацюків (8107.0-8865.9 мг/кг) при значенні КМЧ (коефіцієнт міжвидової чутливості) ~ 0,85 свідчить про можливість міжвидової екстраполяції отриманих результатів токсичності. Хронічний токсикологічний експеримент проводили на білих пацюках масою 204.5 ± 10.2 гр. протягом 120 днів, доза препарату складала 0.1, 0.01 і 0.04 від середньолетальних ефектів дії. Визначали вплив препарату на "основні інтегральні показники", динаміку змін периферичної крові і поверхнево-активних властивостей сурфактантної системи легень. Таким чином, було встановлено, що максимально переносима доза Протефлазіду в хронічному експерименті складає 0.1 від LD 50, а поріг хронічної пристосувально - фізіологічної дії ~ 90 мг/кг. За даними дослідження гострої і хронічної токсичності препарат Протефлазід віднесений при введенні per os до 4-го класу токсичності (мало небезпечним речовинам). Вплив Протефлазіду на функціональний стан гепатоцитів вивчався при постановці гексеналової проби in vivo на статевозрілих пацюках у динаміці при пероральному введенні лікарського засобу (0.01 від LD 50) протягом 30 діб. Аналіз тривалості гексеналового сну вказує на те, що введення Протефлазіду в субтоксичних дозах статистично доведених змін не викликає, а також установлено, що пероральне введення препарату (0.001 від LD 50) не впливало на показники екскреторної функції нирок у тварин. Не встановлено видових і статевих розходжень у чутливості зазначених тварин до токсичної дії препарату. Мутагенність Дослідження мутагенності передбачає оцінку здатності Протефлазіду до індукції різних типів мутацій в ембріональних і активно проліферіруючих соматичних клітинах. Тестування Протефлазіду на мутагенність проводилося в експерименті in vitro на людській ембріональній тканині та in vivo на клітинах кісткового мозку мишей. Таблиця 1. Вплив Протефлазіду на мітотичний режим людських ембріональних клітин Вплив на клітини Митотичний індекс, % Аномальні мітози, % Багато-ядерні клітини, % Протефлазід, концентрація 6.8 мкг/мл 15.6±0.3 4.2 - Протефлазід, концентрація 0.68 мкг/мл 15.3±0.3 6.1 - Інтактні клітини 16.0±0.4 6.25 - Як видно з представлених у Таблиці 1 даних, не відзначалося істотних розходжень мітотичного режиму в людських ембріональних клітинах, оброблених препаратом Протефлазід у концентраціях 6.8 мкг/мл і 0.68 мкг/мл, при порівнянні з інтактними клітинами. Таблиця 2. Вплив Протефлазіду на хромосоми клітин ЛЕТ Вплив на клітини % аберантних хромосом Аберації хромосом, % пробіли хроматидні розриви пульверізація ендоредуплікація Протефлазід у концентрації 6.8 мкг/мл 6.0±1.0 100.0 - - - Протефлазід у концентрації 0.68 мкг/мл 5.0±0.9 100.0 - - - Інтактні клітини 4.0±0.8 100.0 - - - З представленої Таблиці 2 випливає, що Протефлазід у концентраціях 6.8 мкг/мл і 0.68 мкг/мл не приводив до збільшення числа аберантних метафаз, отже, вивчений препарат не має мутагенних властивостей. Мутагенні властивості препарату Протефлазід були вивчені в експериментах in vivo на білих безпородних мишах. Препарат вводили в дозі 6.8 мкг/мл per os. Використовували за умовами експерименту однократне і чотириразове введення при наявності негативного і позитивного контролю. При вивченні цитогенетичної активності Протефлазіду на білих мишах установлено, що він не мав мутагенної дії. При одноразовому введенні тваринам відсоток аберантних метафаз склав 3.2±0.7 %, при чотириразовому введенні - 3.4±0.8 %. У групі негативного контролю цей показник дорівнював 3.0±0.7 %, позитивного - 14.2±1.5 %. Показники аберрантных метафаз у досліджувальних групах (введення Протефлазіду одноразово і чотириразово), а також у негативному контролі вірогідно відрізнялися від позитивного контролю (t=6.4; t=6.1; t=6.4 - відповідно, табличне значення t= 3.0). Таким чином, за даними вивчення цитогенетичної активності Протефлазіду, можна зробити висновок, що досліджуваний препарат не мав мутагенної активності. Тератогенный ефект препарату оцінювали в досвіді in vivo на дорослих, репродуктивних пацюках масою 180 - 240 гр., що були розділені на 2 групи, по 10 тварин у кожній групі. У дослідну і контрольну групи були введені по 2 самця для спарювання, що не одержували Протефлазід. Самки одержували препарат протягом усієї вагітності per os у дозі 0.1 - 0.01 від LD 50. Оцінка результатів дослідження фето- і ембріотоксичного впливу проводилася на підставі наступних критеріїв: кількість немовлят і термін народження; маса тіла при народженні й у наступних спостереженнях протягом 30 днів; аномалії розвитку, а саме: аномалії розвитку кістяка, кінцівок і сечостатевої системи; атипічні ознаки на макроморфологічних препаратах, виготовлених на 1, 14, 30 і 45 добу. Установлено, що достовірних відмінностей серед приведених показників у досвідченій і контрольній групах відзначено не було. Імунотоксичний вплив препарату вивчали на 91 білих статевозрілих мишах і 25 білих пацюках лінії Вістар, на наступних експериментальних моделях: початкова гуморальна відповідь на Th-залежний антиген, РГЗТ, РБТЛ на мітогени (ЛПС і ФГА), фагоцитарна активність нейтрофілів. Препарат уводився per os три рази 3 на добу в дозі 3 краплі/кг маси тварини, (що відповідає 40-50 краплям для людини). По показниках гуморальної відповіді досліджувані дозування не впливали на показники маси тіла, маси тимуса і циркулюючих антитіл. Відзначено зниження абсолютного і відносного показників маси селезінки і тенденцію до зменшення титру гемолізінов, зокрема гемагглютинінів. Вивчення РГЗТ на мишах показало, що мається тенденція до зниження активності РГЗТ під дією препарату. РБТЛ досліджувалася в досвідах in vivo. Оцінку реакції здійснювали за коефіцієнтом гіпертрофії підколінних лімфатичних вузлів. Тваринам вводили мітогени - ЛПС, ФГА. Препарат вводили з дня введення мітогенів протягом 4-х діб. Встановлено, що РБТЛ на мітогени під дією препарату не мала прогресуючого характеру. Були відсутні зміни показників коефіцієнтів гіпертрофії лімфатичних вузлів у дослідній та контрольній групах. Дослідження фагоцитарної функції нейтрофілів з використанням стандартних тест-мікробів - агатної культури E. соlі АТСС 25422 показали, що застосування препарату істотно не змінює кількість активних нейтрофілів. Відзначено тенденцію до збільшення показника коефіцієнта поглинання нейтрофілів. Статистично вірогідно спостерігається підвищення поглинаючої та переварюючої здатності фагоцитів. Канцерогенність Тестування на канцерогенність у системі доклінічного вивчення безпеки Протефлазіду містить наступні дослідження: тест Еймса Salmonella typhimurium - штами ТА 98, ТА 100 / індукція мутагенезу в індикаторній системі при метаболичній активності фракції S-9 печінки пацюків. Показано, що Протефлазід не збільшує частоту генних мутацій, у той же час спостерігається тенденція до зменшення частоти мутацій. Доведено відсутність промутагенного впливу препарату. антипроліферативна активність лікарського засобу в експерименті in vivo у білих безпородних мишей на моделях: саркоми Крокера, лімфосаркоми Плисса, лімфолейкозу L 1210, карценоми Герена. Показано, що при введенні per os препарат мало впливає на ріст пухлин, однак при парентеральному введенні спостерігається гальмування росту пухлини від 10 до 40 % у залежності від моделі. При цьому істотно збільшується тривалість життя. У результаті проведених досліджень доведено, що Протефлазід не индукує генних мутацій і хромосомних ушкоджень у клітинах, володіє незначною антитуморозною активністю. Таким чином, Протефлазід відповідає існуючим вимогам щодо канцерогенної безпеки. Екофармакологічна дія Відомо, що більшість вірусних захворювань, а також екотоксикантів негативно впливають на прояви психічної діяльності і фізичної працездатності. В умовах використання стресово-конфліктної ситуації серед тварин доведено, що Протефлазід сприяє підвищенню дієздатності (м'язової працездатності) і більш повної "психічної" реалізації в екстремальних умовах. Однією з основних специфічних властивостей екофармакологічних препаратів є здатність зменшувати дію токсичних речовин на організм. При вивченні детоксикаційних властивостей препарату була прийнята альдінамідна модель інтоксикації (доза протитуберкульозного препарату альдінаміда складала 150 мг/кг), а також моделі з використанням екотоксикантів: ДДТ, бензол, формальдегід (доза 0.5 від LD 50). Зазначені дози токсикантів приводять до формування екстремальної токсичної поразки. За умовами досліду, токсиканти в зазначених вище дозах уводили per os на протязі трьох діб (контрольна група). В експериментальній групі, із другої доби, тваринам, що одержують токсиканти, уводимо Протефлазід per os 1-2 краплі на 200 грам (~ Lim ac) протягом 3-х діб. Під впливом токсикантів у контрольних групах (без препарату) з 1 по 14 добу загинуло від 40 до 80 % тварин, а в експериментальних групах не більш 3 %. Починаючи з 15-ої доби, по стану інтегральних показників здоров'я тварин, показників осмотичної резистентності еритроцитів, поверхневої і внутрішньої аутофлори, а також кількості E. соlі (in oris, на боковій стороні тіла) відмінностей експериментальних груп від "чистих" тварин не спостерігалося. В умовах хронічного експерименту були вивчені детоксикаційні ефекти препарату при інгаляційному введенні експериментальним тваринам формальдегіду, формаліну, бензолу, ДДТ у дозах п'ятикратним Пдкрз (ДСТ 12.1.005-88). Починаючи з 30-ої доби, тварини, крім токсикантів одержували Протефлазід у дозі Lim ac. На 121 добу тварини виводилися з експерименту. Аналіз гемограми, функціонального стану печінки, біохімічних показників функціонального стану нирок дозволяють зробити висновок, що в умовах тривалого введення екотоксикантів Протефлазід істотно поліпшує показники крові, детоксикаційну функцію печінки та нирок, сприяє адаптації організму до несприятливих впливів. Механізми фармакологічної дії препарату Хіміотерапевтичний індекс Для визначення максимально переносимої концентрації (МПК) препарату Протефлазід використовували клітини МДВК (перевіваємі клітини нирки теляти). МПК препарату відповідала 6.8 мкг/мл, що збігалося з концентрацією спирту. Тому, МПК Протефлазіду (6.8 мкг/мл), імовірно, значно вище. Хіміотерапевтичний індекс (ХТІ) Протефлазіду стосовно вірусу везикулярного стоматиту визначали шляхом установлення співвідношення МПК до мінімально активної концентрації (МАК), що являє собою мінімальну кількість препарату, що гальмує розвиток вірус специфічного ЦПД на 50 %. Для визначення МАК тест-вірус у дозі 100 ТЦД50/0,1 мл вносили в культуру клітин МДВК і інкубували протягом 1 години при 37о С. Після адсорбції вірусу на клітинах, його видаляли і клітини відмивали живильним середовищем 199, після чого в підтримуюче середовище (RPMI-1640 + 2 % фетальної сироватки) вносили Протефлазід у концентраціях від 0.85 до 0.05 мкг/мл. Відсутність ЦПД у досліді, при наявності його в контролі, дозволило виявити МАК препаратів (таблиця 3). Таблиця 3. МАК Протефлазіду у відношенні вірус везикулярного стоматиту Концентрація препарата, мкг/мл Титр віруса, lg TЦД50 Ингібіруюча активність, lg ID50 0.85 0 5.0 0.425 0 5.0 0.212 0 5.0 0.101 2.0 3.0 0.05 3.0 2.0 контроль віруса 5.0 - Відповідно до методичних рекомендацій, речовина чи препарат вважають проявляючим активність при зниженні рівня репродукції вірусу на 2.0 lg і більше, отже, МАК Протефлазіду відповідають 0.05 мкг/мл. Результати визначення МПК, МАК і ХТІ представлені в таблиці 4. Таблиця 4. Результати визначення МПК, МАК і ХТІ Протефлазіду Препарати МПК, мкг/мл МАК, мкг/мл ХТІ Протефлазід 6.8 0.05 136 Спиртовий р-р, 91% 0.91 - - Як видно з представленої таблиці 4, показники МПК, МАК і ХТІ дозволяють віднести препарат Протефлазід до високоактивних антивірусних препаратів. Антигерпетична активність Протефлазіду Антигерпетичну активність (ВПГ-1) препарату вивчали на моделі герпесвірусного менінгоенцефаліту в білих мишей. Дана модель зручна для оцінки виразності симптоматики, відрізняється 100 % відтворюваністю і не вимагає застосування додаткових контролів. Розвиток клінічних симптомів захворювання в контролі починався на 5-6-у добу з моменту інфікування, досягав максимуму до 13-14 доби і далі відзначалося зменшення виразності симптоматики з наступним клінічним видужанням тварин, що вижили. Наявність гострої герпетичної інфекції підтверджувалася за допомогою имунофлюоресценції. Так, найбільш інтенсивне світіння спостерігалося в тканинах головного мозку (особливо в стовбурних відділах), що з'являлося через 6-7 діб з моменту інфікування, що відповідає моменту появи клінічних ознак захворювання. Менш інтенсивне світіння (+ чи ++) відзначалося в селезінці і було відсутнє в печінці і легенях. Летальність тварин, інфікованих вірусом герпесу простого, складала 100 %. Для моделювання експериментальної герпетичної інфекції використовували вірус герпесу простого 1 типу. Вірус пройшов у лабораторії 24 пасажа через мозок білих мишей. Вірусовміщуючий матеріал уводили мишам усередину мозку в обсязі 0.03 мл. Величина дози, що заражає, у дослідах дорівнювала 1-10 LD50 (мишачих летальних доз). Інфекційну активність вірусу герпесу вивчали по летальності тварин і інфекційному титру вірусу в мозковій тканині мишей. Антигерпетичну активність (ВПГ-2) препарата вивчали на моделі генітальної герпетичної інфекції морських свинок, що відтворювали шляхом зараження останніх вірусовміщуючою рідиною з інфекційним титром 5.0-5.5 lg ТЦД50/мл за методикою запропонованою С.С. Маренніковой [12]. Вірусовміщуючу рідину наносили на попередньо скарифіковану шкіру penis. Скарифікацію проводили за допомогою хірургічного ланцета, після того як тварини були анестезовані ефіром. Розмір поверхні скарифікації дорівнював 4-7 мм2. Вірусовміщуючу рідину вводили за допомогою піпетки відразу після скарифікації (з наступним утиранням). Клінічні симптоми експериментального герпесу геніталій реєстрували щодня перед проведенням лікування і спостерігали протягом усього періоду хвороби. Критеріями оцінки тяжкості інфекційного процесу були поверхня і ступінь специфічних поразок, наявність набряку, гіперемії, орхіту. Максимальна виразність кожної ознаки складала 4 бали. Спостереження за тваринами проводили протягом 21 дня. Кожна досліджувана група складалася з 3 тварин. Розчин Протефлазіду в дозі 6.8 мкг/мл і 0.68 мкг/мл наносили на скарифіковану і заражену поверхню 1 раз на добу протягом 5 днів. Як референс-препарат використовували мазь віролекс фірми KRKA (Словенія), що наносили так само як досліджуваний препарат Протефлазід: аплікації на поверхню рани щодня протягом 5 днів. Лікування з використанням Протефлазіду і віролексу починали через 2 години після інфікування. Віруси простого герпесу володіють кератотропними властивостями і викликають офтальмовірусну патологію при зараженні на роговицю ока. Найбільш придатним і доступним видом тварин для цих цілей є кролики. Ця модель зручна й інформативна, тому що легко відтворюється, близька до клінічної картини захворювань у людей, дає чіткі результати терапевтичної ефективності, що корелюють із противірусною активністю випробуваної речовини, встановленої в культурі клітин і на мишах. Використовували молодих кроликів породи "шиншилла" з масою тіла 2-2.5 кг. Герпетичний кератит викликали в такий спосіб. Перед зараженням ока анестезували закапуванням у кон"юктивальний мішок 0.5 % розчину дикаіна. Потім фіксували очне яблуко. Гострою голкою наносили поверхневі лінійні насічки (у шарі епітелію) у виді 3 взаємно перпендикулярних смуг. Для зараження використовували 10 % суспензію мозку інфікованої вірусом герпесу миші. Вірусовміщуючий матеріал наносили на ушкоджене місце в кількості 0.01 мл. Віка щільно стуляли і злегка втирали інокулят у роговицю. Спостереження за розвитком клінічної картини кератиту проводили, розглядаючи щодня ока за допомогою бінокулярної лупи. Перший прояв інфекційного процесу виражався в утворенні дрібних пухирців уздовж насічок на роговиці, що незабаром зливалися, утворюючи поразки, що нагадують гілочку. Звичайно на роговиці з'являлися 2-3 такі гілочки. Лікування з використанням розчинів Протефлазіду концентрацією 6.8-0.68 мкг/мл починали через 24 години після інфікування, щодня 1 раз на добу закапували протягом 3 днів. Усього в досліді було 3 групи тварин по 3 кролика в кожній групі: 1 - кролики, роговицю яких заражали вірусом герпесу, 2 - кролики, заражені вірусом герпесу + лікування Протефлазідом у концентрації 6,8 мкг/мл 3 - кролики, заражені вірусом герпесу + лікування Протефлазідом у концентрації 0,68 мкг/мл. Вивчення антигерпетичної активності препарату Протефлазід у досвідах in vitrо Для вивчення антивірусної активності Протефлазіду використовували культуру клітин, що перевивається, Vero (клітини нирки мавпи). Клітини вирощували в плашках на середовищі RPMI-1640+10 % фетальної сироватки (Nunclon, Surface, Denmark) при температурі 37о С в термостаті з подачею СО2. Використовували вірус герпесу 1-го типу, штам VC (ВПГ), інфекційний титр - 6.5 lg ТЦД50. Для вивчення антивірусної активності використовували добові культури клітин Vero із суцільним моношаром клітин. Середовище росту зливали, на моношар клітин наносили препарат Протефлазід у різних концентраціях або вірус герпесу в залежності від модифікації експерименту. Через 1 годину контакту неадсорбувавшийся вірус герпесу видаляли й у лунки вносили підтримуюче середовище (живильне середовище без сироватки). Наступного дня в лунки плашок, що інкубувались з різними розведеннями препарату Протефлазід вносили вірус герпесу в дозі 100 ТЦД50 , а в лунки, що були інфіковані вірусом герпесу, вносили різні розведення препарату. Культури інкубували в термостаті з подачею СО2 протягом 5 діб щодня мікроскопіруя і відзначаючи репродукцію вірусу по цитопатичній дії ВПГ на клітини Vero у порівнянні з контрольними культурами, де моношар не піддавався ніяким впливам. Цитопатична дія ВПГ на клітини морфологічно виявляється в утворенні симпластів чи округлих клітин у сполученні з проліферацією і гігантськими багатоядерними клітинами. Через 5 діб культуральне середовище з лунок плашок збирали і визначали інфекційний титр у кожній пробі при профілактичній і лікувальній дії препарату. Результати репродукції ВПГ при профілактичному і лікувальному введенні препарату представлені в таблицях 5,6. Таблиця 5. Профілактична дія Протефлазіду на репродукцію ВПГ у культурі клітин Vero Концентрація препарату мкг/мл Вірус герпесу 100 ТЦД50 Інфекційний титр у lg ТЦД50 Ингібіруючий інфекційний титр у lg ТЦД50 6.8 + 0 6.0 3.2 + 1.0 5.0 1.7 + 2.0 4.0 0.85 + 2.0 4.0 0.425 + 2.0 4.0 0.212 + 2.0 4.0 0 + 6.0 - Таблиця 6. Лікувальна дія Протефлазіду на репродукцію ВПГ у культурі клітин Vero Концентрація препарату мкг/мл Вірус герпесу 100 ТЦД50 Інфекційний титр у lg ТЦД50 Інгібіруючий інфекційний титр у lg ТЦД50 6.8 + 0 6.0 3.2 + 1.5 4.5 1.7 + 2.0 4.0 0.85 + 2.0 4.0 0.425 + 2.0 4.0 0.212 + 3.0 3.0 0 + 6.0 - Аналізуючи результати, представлені в таблицях 5 і 6, слід зазначити, що при профілактичному і лікувальному впливі різних концентрацій Протефлазіду (від 6.8 до 0.212 мг/мл) відзначалася виражена противогерпетична активність. Вплив препарату Протефлазід на мітотичний режим і хромосоми кліток ЧЕТ, заражених вірусом герпесу Вплив Протефлазіду на мітотичний режим і хромосоми проводили в первинно-тріпсінізованій культурі клітин, що заражали вірусом герпесу (ВПГ-1 типу). Були вивчені наступні групи: контроль культури клітин (негативний контроль); зараження вірусом герпесу; одномоментне зараження ВПГ + препарат у дозі 6.8 мкг/мл; одномоментне зараження ВПГ + препарат у дозі 0.68 мкг/мл. Результати представлені в таблиці 7. Таблиця 7. Вплив Протефлазіду на мітотичний режим людських ембріональних клітин Вплив на клітини Мітотичний індекс, % Аномальні мітози, % Багатоядерні клітини, % Протефлазід, концентрація 6.8 мкг/мл +ВПГ 15.3 ± 0.3 4.4 ± 0.2 - Протефлазід, концентрація 0.68 мкг/мл +ВПГ 16.3 ± 0.3 8.6 ± 0.2 - Інтактні клітини 16.0 ± 0.3 6.25 ± 0.2 - Вірус герпесу 10.6 ± 0.3 23.6 ± 0.4 0.2 Протефлазід 6.8 мкг/мл 15.6 ± 0.3 4.2 ± 0.2 - Протефлазід 0.68 мкг/мл 15.3 ± 0.3 6.1 ± 0.2 - Зараження клітин вірусом герпесу приводило до зниження мытотичного індексу клітин (10.6 і збільшенню числа патологічних форм мітозів (багатополюсні метафази, відставання хромосом при розбіжності, розсіювання хромосом у метафазі) - 23.6 % у порівнянні з інтактними клітинами і клітинами, обробленими Протефлазідом. Таким чином, при одномоментному зараженні клітин ВПГ і обробкою їх Протефлазідом не встановлено змін мітотичного режиму. Вивчення впливу препарату Протефлазід на хромосоми клітин проводили в первинно-тріпсінізованній людській ембріональній тканині. Результати представлені в таблиці 8. Таблиця 8. Вплив Протефлазіду на хромосоми клітин ЛЕТ Вплив на клітини % аберантних хромосом Аберрации хромосом, % Пробіли Хроматидні розриви Пульверизація Ендоре дуплікація Протефлазід у концентрації 6.8 мкг/мл 6.0±1,0 100.0 - - - Протефлазід у концентрації 0.68 мкг/мл 5.0±0.9 100.0 - - - Інтактні клітини 4.0±0.8 100.0 - - - Вірус герпеса 13.0±1.5 53.8 15.4 15.4 15.4 Протефлазід в концентрації 6.8 мкг/мл + вірус герпеса 5.0±0.7 66.6 33.4 - - Протефлазід в концентрації 0.068 мкг/мл + вірус герпеса 6.0±1.0 66.6 33.4 З представленої таблиці випливає, що Протефлазід у концентраціях 6.8 мкг/мл і 0.68 мкг/мл не приводив до збільшення числа аберантних метафаз, отже, вивчений препарат не має мутагенних властивостей. Вірус герпесу викликав збільшення числа аберантных метафаз у 2-3 рази (t=3.8) у порівнянні з даними, отриманими в інших групах експерименту, що узгоджується з даними, отриманими Н.І.Зацепіним із соавт. [13], В.Н.Блюмкіним і В.М.Ждановим [9] культурі фібробластів людини. При зараженні зазначеної культури симпластоутворюючим вірусом герпесу відбувалося значне наростання кількості аберантних метафаз у порівнянні з контрольними культурами - 14.5 % проти 4.68 % у контрольних культурах. У наших дослідженнях у клітинах ЛЕТ, оброблених Протефлазідом і заражених вірусом герпесу, не встановлено достовірного збільшення числа аберантних метафаз, що свідчить про захисну дію досліджуваного препарату. Вивчення антигерпетичної активності Протефлазіду в експериментах in vivo Антигерпетичну активність (ВПГ-1) препарату Протефлазід вивчали на моделі герпесвірусного менінгоенцефаліта в білих безпородних мишей. Препарати вводили по 0.25 мл per os по таких схемах: до інфікування і щодня протягом 3 діб - профілактична схема введення; через 24 години після зараження вірусом герпесу - лікувальна схема. Кожен дослід складався з чотирьох груп тварин: миші, яким уводили Протефлазід у концентрації 0.340 мкг/кг + вірус герпесу; миші, яким уводили Протефлазід у концентрації 0.068 мкг/кг + вірус герпесу; миші, яким уводили віролекс + вірус герпесу; миші, яким уводили фізіологічний розчин + вірус герпесу. Оцінку активності препаратів проводили шляхом порівняння летальності в досвідченій і контрольній групах. При цьому враховували: відсоток летальності тварин; кратність захисту (КЗ) - кратність зменшення кількості загиблих мишей у дослідній групі в порівнянні з контрольною; індекс ефективності (ІЕ) препарату визначали по формулі: кратність захисту - 1 ІЕ = ------------------------------- х 100 кратність захисту Перша схема дослідження включала вивчення активності Протефлазіду під час профілактичного введення в дозі 6.8 мкг/мл. Результати приведені в таблиці 9. Таблиця 9. Протективна дія препарату Протефлазід при профілактичному введенні на моделі герпесвірусного менінгоенцефаліту в мишей Препарат Доза, мг/кг К-сть мишей З них загинуло КЗ ІЄ Інгіб. інф. титр в тканині мозку мишей всего % Протефлазід 0.340 10 8 80 1.25 37.5 1.5 Протефлазід 0.068 10 5 50 2.0 50.0 3.0 Віролекс 100 10 7 70 1.4 28.0 2.5 Плацебо 10 10 100 - - На підставі даних, приведених у таблиці 9, можна зробити висновок, що препарат Протефлазід володіє вираженою профілактичною дією в дозі 0.068 мг/мл. У наступній серії дослідів Протефлазід і віролекс уводили мишам через 24 години після зараження їх вірусом герпесу - лікувальна схема. Результати приведені в таблиці 10. Таблиця 10. Захисна дія Протефлазіду при лікувальній схемі введення мишам, зараженим вірусом герпесу Препарат Доза, мг/кг К-сть мишей З них загинуло КЗ ІЄ Інгіб. інф. титр в тканині мозку мишей загалом % Протефлазід 0.340 12 8 66.6 1.5 33.3 1.5 Протефлазід 0.068 10 7 30.0 1.43 30.0 1.5 Віролекс 100 12 7 58.3 1.7 41.17 2.5 Плацебо 10 10 100 - - З приведених даних у таблиці 10 можна зробити висновок, що Протефлазід виявляє лікувальну дію, тому що ІЕ - 30.0 і вище, є показником противогерпетичної активності in vivo на моделі менінгоенцефалиту. Вивчення впливу Протефлазіду на хромосоми клітин кісткового мозку мишей, заражених вірусом герпесу Наступним етапом роботи було вивчення впливу Протефлазіду на хромосоми клітин кісткового мозку мишей, заражених вірусом герпесу. Антивірусні властивості препарату Протефлазід були вивчені в експериментах in vivo на білих безпородних мишах. Препарат вводили в дозі 0.34 мг/кг per os, внутрімозкове зараження вірусом герпесу здійснювали за добу до введення препарату (лікувальна дія) і через добу після введення препарату (профілактична дія). У кожній групі тварин було по 5 особин. 1 група - негативний контроль (інтактні миші), 2 група - мишей заражали вірусом герпесу, 3 група - мишам уводили препарат у концентрації 0.34 мг/кг, через 24 години заражали вірусом герпесу - профілактика, 4 група - мишей заражали вірусом герпесу і через 24 години вводили препарат у дозі 0.34 мг/кг - лікування. Приготовлені по 2 стекла від кожної тварини, усього в кожній групі проаналізоване по 500 метафазних пластинок. Результати представлені в таблиці 11. Таблиця 11. Цитогенетичну активність Протефлазіда в клітинах кісткового мозку білих безпородних мишей Умови експерименту К-сть мышей К-сть клеток Кількість аберацій Множабер. к-сть Пробіли, к-кість Частка зруйнованих клітин % Один. фрагм Пар-ні фрагм Обміни Вірус герпеса 5 500 21 15 5 10 38 89 19.8+1.7 Вірус герпеса + Протефлазід профілактика 5 500 8 1 0 0 19 28 5.6+1.0 Вірус герпеса + Протефлазід лікування 5 500 11 5 3 5 41 65 13.0+1.5 Інтактні миші 5 500 6 0 0 0 9 15 3.0+0.7 Протефлазід однократне введення 5 500 6 0 0 0 10 16 3.2+0.7 Як видно з представленої таблиці 11, при профілактичному введенні Протефлазіду мишам, зараженим вірусом герпесу, рівень аберантных метафаз склав 5.6±1.0 %, при зараженні мишей вірусом герпесу цей показник дорівнював 19.8±1.7%, (вірогідність розходжень склала t =7.3), у той же час при лікувальній схемі досліду число метафаз з порушеннями хромосом дорівнювало 13.0±1.5 %, вірогідність розходжень з даними, отриманими в групі тварин, заражених вірусом герпесу, склала t = 3.0. У таблиці 12 представлені дані по розподілу типів ушкоджень хромосом при профілактичній і лікувальній схемі введення Протефлазіду мишам, зараженим вірусом герпесу. Таблиця 12. Типи ушкоджень хромосом у клітинах кісткового мозку мишей при профілактичній і лікувальній схемі введення Протефлазіду мишам, зараженим вірусом герпесу Умови експерименту Типи аберацій хромосом Хромосомні Хроматидні Вірус герпеса 33.7±2.1 66.3±2.1 Вірус герпеса + Протефлазід (профілактика) 3.5±0.8 96.5±0.8 Вірус герпеса + Протефлазід (лікування) 20.0±1.7 80.0±1.7 Інтактні миши 0 100.0 Протефлазід (1-кратне введення) 0 100.0 З представленої таблиці 12 видно, що частка аберацій хроматидного типу (одиночні розриви і пробіли) у всіх групах переважала. Перевага аберацій хроматидного типу дає підставу зробити висновок про те, що ушкодження хромосом відбувається в періоді S чи G2 клітинного циклу, що є додатковим підтвердженням дії вірусу герпесу на хромосоми по типу локальних інгібіторів синтезу ДНК [14]. При цьому слід зазначити, що Протефлазід значно знижував рівень аберацій хромосомного типу як при профілактичному введенні (t=11.1), так і лікувальному (t=6.5) у порівнянні з групою мишей, заражених вірусом герпесу. Тобто, застосування Протефлазіду при герпетичній інфекції перешкоджає виразності хромосомних ушкоджень. При профілактичному введенні Протефлазід цілком запобігає дії вірусу герпесу на хромосоми і статистично вірогідно знижує рівень хромосомних аберацій при введенні препарату з профілактичною метою. Вивчення впливу Протефлазіду на моделі статевого герпесу Антивірусну активність розчину Протефлазіду різних концентрацій субстанції досліджували на моделі генітального герпесу в морських свинок. Лікування з використанням розчину Протефлазіду і віролексу починали через 24 години після інфікування. Усього в досліді було 5 груп тварин: тварини, яких заражали тільки вірусом герпесу; тварини, яких заражали вірусом герпесу і лікували віролексом; тварини, яких заражали вірусом герпесу і лікували розчином Протефлазіду у концентрації 6.8 мкг/мл; тварини, яких заражали вірусом герпесу і лікували розчином Протефлазіду у дозі 1.36 мкг/мл; тварини, яких заражали вірусом герпесу і лікували розчином Протефлазіду у дозі 0.68 мкг/мл. При дослідженні ефективності розчину Протефлазіду на моделі генітального герпесу в морських свинок були отримані наступні дані (таблиця 13). Таблиця 13. Ефективність розчину Протефлазіду на моделі генітального герпесу в морських свинок Групи тварин Препарат мкг/мл Тривалість захворюваня доба р СІВЗ, бали ІЛД % 1 контроль зараження 15 ± 3.2 51.0 2 віролекс 9.75 ± 2.86 <0,05 22.0 56.0 3 Протефлазід 0.68 12.5 ± 1.39 >0.05 28.5 40.0 4 Протефлазід 1.36 9.0 ± 1.39 <0.05 20.2 60.0 5 Протефлазід 6.8 5.0 ± 0.5 <0.05 5.0 95.0 Було показано, що використання розчину Протефлазіду у концентрації 0.68 мкг/мл 1 раз у добу протягом 3 днів знижувала виразність симптоматики до 28.5 балів, що відповідає терапевтичному ефекту на рівні 40 % (р<0.05), однак вірогідно не скорочувало тривалості захворювання. Збільшення концентрації препарату Протефлазід до 1.36 мкг/мл привело до зниження симптоматики до рівня 20 балів, терапевтичний ефект склав - 60 %, тривалість захворювання у тварин склала 9 днів, що статистично вірогідно по всіх параметрах і вказує на ефективність препарату в даній дозі. При використанні розчину Протефлазіду у концентрації 6.8 мкг/мл 1 раз у добу протягом 3 днів, виразність симптоматики була незначною - 5 балів: ледь помітна гіперемія в місці скарифікації і внесення вірусу, без набряків і орхіту. Тривалість гіперемії склала 5 діб, терапевтичний ефект - 95 %. Таким чином, у серії експериментів показано, що Протефлазід у концентрації 1.36 мкг/мл виявив виражену антивірусну дію, а в концентрації 6.8 мкг/мл - майже цілком запобіг виникненню специфічної симптоматики. Вивчення впливу Протефлазіду на моделі герпетичного кератиту в кролів Наступним розділом роботи було вивчення ефективності Протефлазіду на моделі герпетичного кератиту кроликів. Результати вивчення ефективності Протефлазіду на моделі герпетичного кератиту кроликів представлені в таблиці 14. Таблиця 14. Ефективність Протефлазіду на моделі кератиту ока кролів Груп. тварин Препарат мкг/мл Тривалість захворювання (дні) Початок прояви захворювання (час) Ступінь прояву 1 Плацебо 17 48 пухирці впродовж насічок, 3-5 ерозій гіперемія 2 Протефлазід 6.8 9 72 пухирці впродовж насічок, 2 ерозії гіперемія 3 Протефлазід 0.68 0 - - Згідно представлених даних, обробка Протефлазідом у концентрації 0.68 мкг/мл цілком запобігала розвитку кератиту в кроликів, застосування розчину Протефлазіду в концентрації 6.8 мкг/мл зменшувало тривалість плину, трохи подовжуючи терміни первинних проявів захворювання і виразність прояву інфекційного процесу. Вивчення проти-ВІЧ активності препарату Протефлазід Для оцінки противірусної активності досліджуваного препарату рослинного походження була використана традиційна модель первинно - інфікованих клітин МТ-4. Варто врахувати, що робота з ВІЧ вимагає дотримання особливих правил її виконання, що припускають забезпечення високого ступеня захисту і кваліфікації працюючого персоналу. Дослідження проводилися в спеціально обладнаних приміщеннях із залученням відповідного устаткування. Штам ВІЧ-1, що використаний у роботі, був отриманий з Інституту вірусології ім. Д.І. Іванівського Російської АМН у 1997 році. Інфікування клітин МТ-4 штамом ВІЧ-1 проводили додаванням вірусу до клітинної суспензії з концентрацією 2х10·6 клітин/мл і множинністю зараження 1.0 lg ID 50. Інгібіруючий ефект препарату оцінювався на 5-у добу культивування по кількості вірусного антигену имуноферментними методами (тест система HIV Monoclonal фірми Еббот, США). Крім цього проводився облік значення по інфекційному титру ВІЧ. Дослідження проводили з застосуванням препарату і при контролі на ВІЧ без препарату. Як досліджувані концентрації Протефлазіду, внесеного в лунки використовували 1.1 % 1.0 % і нативний препарат у дозі 5 мкл на одну лунку. Результати експериментального вивчення проти-ВІЧ активності Протефлазіду приведені в таблиці 15. Таблиця 15. Вплив Протефлазіду на репродукцію ВІЧ у культурі клітин МТ - 4. Умови досліду Експресія ВІЧ, титри р24 ВІЧ-1, мкг/мл Інфекційний титр в lg ID50 Дія Протефлазиду 45 2.0 Контроль на ВІЧ 140 5.0 У результаті проведених досліджень експериментально було показано, що препарат рослинного походження - Протефлазід вірогідно інгібірує репродукцію вірусу імунодефіциту людини в досліджуваних дозах. Це виявляється як відображення інгібіції експресії антигену р24 ВІЧ-1, так і на достовірному зниженні інфекційного титру на 3.0 і 4.0 lg ID50. Механізми дії Протефлазіду Інтерфероногенна активність препарату в культурі лейкоцитів. Препарат Протефлазід у різних дозах додавали до 3 млн лейкоцитів донорів людини і культивували при 37о С на протязі 24 годин. Через 24 години надосадову рідину збирали і доводили її рН до 2.0, залишали при 4о на 48-72 години, потім рН рідини відновлювали до 7.3 і в ній визначали рівень інтерферону за відомою методикою придушення ЦПД вірусу везикулярного стоматиту в культурі клітин, що перевиваються, МДВК. Результати приведені в таблиці 16. Таблиця 16. Рівень інтерферону, продукуємий Протефлазідом у культурі лейкоцитів людини Протефлазід в дозах, мкг/мл Активність ІФН, МЕ 50/мл 6.8 1280 3.4 640 1.7 640 0.85 320 0.68 320 0.068 80 Поли{И}:поли{Ц}* 2560 З представленої таблиці видно, що Протефлазід дозозалежно стимулює продукцію інтерферону в лейкоцитах людини. Типування інтерферону, індукованого в лейкоцитах людини представлено в таблиці 17. Таблиця 17. Типування інтерферону, індукованого в лейкоцитах людини Препарат в мкг/мл Титр інтерферона при Нейтралізація моноклональними антитілами рН 7.0 рН 2.0 +56оС к альфа-ИФН к гамма-ИФН к альфа-гамма ИФН Протефлазід 6.8 1280 160 160 160 320 - Таким чином, Протефлазід є індуктором альфа- і гамма-інтерферону. Вивчення індукції інтерферону in vivo Препарат Протефлазід був вивчений в експерименті in vivo на мишах, яким він був уведений внутрішньочеревно (по 0.2 мл) у дозі 0.34 мг/кг ваги тварини. Через 3, 24 і 48 годин мишей забивали і визначали інтерферон у сироватках крові й органах тварин за загальноприйнятою методикою придушення ЦПД вірусу везикулярного стоматиту в клітинах, що перевиваються, L 929. Результати представлені в таблиці 18. Таблиця 18. Рівень ІФН у сироватках крові й органах мишей, оброблених Протефлазідом Досліджувані органи Активність ІФН в од. акт./мл 3 ч 24 ч 48 ч физ. р-р. 24 ч полі-И полі-Ц Кров без змін рН після змін рН 160 0 640 40 640 160 40 40 1280 1280 Селезінка без змін рН після змін рН 640 80 640 320 640 640 40 40 640 640 Легені без змін рН 640 640 640 40 1280 Печінка без змін рН 320 320 80 40 640 Таким чином, у результаті проведених досліджень, встановлено, що Протефлазід индукує синтез ІФН у високих титрах через 3 години після введення препарату. Зміна рН середовища значно знижує рівень вироблюваного ІФН у 1-у добу (3 години і 24 години), до 48 годин продукція ІФН зростала. Ранній синтез ІФН (3 години), а також вплив зміни рН середовища в 1-у добу на рівень ІФН свідчить про те, що препарат Протефлазід є індуктором альфа- і гамма- ІФН. Вплив Протефлазіду на тімідінкіназну активність у клітинах мозку мишей, заражених вірусом простого герпесу З літературних даних відомо, що спочиваючі клітини мозку містять незначну кількість тімідінкінази. Стресові стани, а до них відноситься вірусна інфекція, підвищують рівні синтезу цього ферменту. Ранніми білками при синтезі герпесвірусів є активатори синтезу білків ДНК-полімераза, тімідінкіназа і цитоплазматичні антигени. Фермент тімідінкіназа входить до складу всіх герпесвірусів. Цей ензим є складовою частиною нуклеозідного комплексу, що катализують реакцію між АТФ і нуклеотидами для утворення нуклеозід- і трифосфатів. Визначення тімідінкіназної активності в гомогенатах мозку мишей проводили по методу [15]
1 2 3 4 5 Категория: Медицина та здоров'я \| Добавил: Aspirant (31.05.2014)
Просмотров: 519 \| Рейтинг: 0.0/0

Всего комментариев: 0


Имя *:
Email *:

Код *: